上篇介绍了采用无标记多模态非线性显微镜进行组织光学评估进而辅助癌症诊断的多种指标，验证了将其运用于术中活检样本检测的可行性。本篇主要介绍这种诊断方法在术中应用的实验验证。术中系统测试使用的犬类样本和成像系统见图1(a)。在样品上用金属切片锚来固定样本的位置，见图1(a)插图。由于术中成像时间限制，每次成像前的都会用俯视相机来确定感兴趣的区域，流程见如图1(b)，通过图1(a)中的激光点来确定扫描起始点，进而控制2D平台移动样本。
图1 成像系统及流程示意图 [1]
图2为30分钟内获得的12个点的成像结果与整个活检样本的H&E组织学图像的对照，可以看出二者在一定关键点高度相似。图中红色箭头表示脂肪细胞簇，红色虚线为肿瘤间质中浸润的上皮细胞、淋巴细胞和浆细胞，白色箭头处可以看到腺小叶。
图2 成像结果对比 [1]
图3比较了犬乳腺肿瘤(a, b)和肿瘤边缘(c, d) SHG图像的傅里叶分析结果。分析方法与上篇一致，肿瘤区域活检组织中的胶原纤维AR值较高，取向性更明显，而肿瘤边缘组织的胶原纤维方向更随机，呈密集的网状形式。
图3 纤维取向性诊断示意图 [1]
计算不同区域组织的氧化还原比（ORR）均值可用于分析组织代谢水平，计算发现肝癌活检样本的ORR平均值比癌旁及发生肝硬化区域的样本低，在不同区域的信号强度分布有很大差异，如图4所示，不同的强度分布也可以用于疾病诊断。
图4 组织代谢水平诊断示意图 [1]
最后一部分实验是在大鼠乳腺组织中进行的，在这部分中用到的装置如图1(c)所示，活检组织一直储存在培养液中，放在带有灌注系统的组织室中，在整个成像过程中，会持续向组织腔内提供PBS。实验组在62min内对活检组织多次观测，结果见图5，在210×210um2的视场内发现视场边缘有一些结构变化，同时2PF、3PF、SHG、THG平均强度分别下降25%、60%、30%、65%，平均ORR从0.94增加到0.97，说明生物活性下降，组织降解。通过测算还发现，在观测开始到27min阶段，ORR及信号平均强度下降严重，27min后到观测结束变化不大，这个结果可以推测到样本降解的时间尺度。
图5 组织完整性纵向观测结果 [1]
随后该课题组又测试了活检样本的组织活性，实验组对照组均成像60分钟，多模态图像分别见图6(a,b）所示。图6(c,d)显示了整个FOV平均2PF和3PF强度以及ORR的变化。与仅灌注PBS的对照组织相比，加入STS导致3PF信号在前30 min内升高，之后下降，说明加入STS后细胞代谢增加，随后由于组织降解而降低。相比之下，当肝组织只灌注PBS时，FOV中的ORR在前40分钟逐渐增加，40min后无明显变化，这与前面讨论的大鼠乳腺癌活检样本的成像结果相似。图6(e,f)为统计学定点分析，说明活检样本具有一定的功能性，对凋亡诱导物有反应，且即使在没有STS干预的情况下，新鲜NB样本随时间发生组织降解。这一对比实验进一步证实了使用无标签成像在手术中的重要性，如果有染料标记物干扰情况下，会出现结构及功能的变化。
图6 组织活性纵向观测结果 [1]
综上，本篇文章主要介绍了无标记多模态非线性显微镜系统光学评估在术中活检样本中的应用，且进一步证明，术中集成化系统具有长时间监测组织完整性和代谢活性的潜力，从而为术中无标记非线性成像开辟了新的研究方向。
参考文献：
[1] Yang L, Park J, Chaney E J, et al. Label-free multimodal nonlinear optical imaging of needle biopsy cores for intraoperative cancer diagnosis[J]. Journal of biomedical optics, 2022, 27(5): 056504-056504.
原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十七 术中活检实时无标记多模态非线性成像（二）
