生物的神经系统可以看作由神经元组成的复杂网络，通过传递电脉冲相互交流。神经元微环境十分复杂，这方面的研究存在许多空白，急需发展多功能、高通量的研究工具。本文搭建了一套多模态无标记光学显微镜系统，用于观察神经元微环境在其原生状态下的活动[1]。
图1 VAMPIRE综合成像平台的对比度来源、系统架构以及激发收集波段汇总示意图[1]
本文的VAMPIRE光学显微系统一共结合了四种无标记对比度来研究神经元活动，包括散射和双折射、代谢辅助因子、分子的自身荧光以及局部生物化学，基于这些对比度搭建了集合自身荧光寿命(FLIM)、偏振敏感的倍频成像(PSHG)、偏振敏感光学相干显微镜(PSOCM)以及拉曼成像(CARS)四个成像模态的综合成像平台，以同时观察神经元结构和动力学的多个方面，见图1(a,b)。图1(c)对用于激发及收集到的信号波段进行了汇总。
图2 VAMPIRE显微镜系统光路架构[1]
系统的光路图见图2，钛宝石激光作为多光子成像系统的激发源，有两个波长的输出。其一为中心波长770 nm，一部分作为相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)模态的泵浦光；另一部分通过一组半波片和偏振分束器(PBS)分束后，经由光子晶体光纤(PCF)将光谱展宽为120 nm带宽； PCF输出后经过抛物面镜准直，经过一组元件调节线偏，该光束再通过1 / 4波片调节为圆偏并调节光束直径后分光，一部分直接进入OCM参考臂，参考臂中放置偏振延迟复用元件来实现偏振敏感OCM测量，另一部分作为OCM测量臂，后续通过立方分束器与CARS模态的Stokes和泵浦光束合束，测量臂获得的OCM信号原路返回与参考臂光一同进入光谱仪产生OCM图像。
光源的另一个输出为1045 nm输出，耦合到PCF产生超200 nm的超连续光谱；再通过一个抛物面镜准直，经由一个光延迟线(ODL)调节Stokes光与泵浦光的延迟为1个激光脉冲周期，随后进入一个傅里叶变换脉冲整形器(FTPS)整形。FTPS由衍射光栅、消色差半波片、圆柱形透镜和二维空间光调制器（SLM）组成。
各光路会合后，通过一对振镜扫描，最终由商用25×物镜聚焦。用605 nm二色镜分离激发光和发射光，随后用不同波长双色镜和滤波器区分各个通道信号，PMT用于收集二倍频、CARS信号，HPD用于收集NADHFAD的荧光强度及寿命信号。
图3 利用NAD(P)H和FAD动力学测试原代海马神经元对光刺激的响应[1]
接下来是具体的实验测量，第一部分是验证用FDGA加速并使用SPEED算法优化的快速FLIM是观察神经元代谢动力学的有力工具，实验记录原代海马神经元中FAD/NADH这两种代谢相关辅酶的荧光强度及寿命，见图3。左上角的四个图为荧光强度寿命的成像结果,通过间隔进行光刺激再静一段时间来观察不同区域神经元细胞反应，测量之后通过kmeans聚类算法来区分出不同的神经元细胞，再通过不同的代谢特征确定神经元细胞类型。
图4 VAMPIRE系统对小鼠离体视网膜成像结果[1]
作者随后测试了在小鼠离体视网膜中视神经细胞的成像（图4），以及对大鼠大脑皮层附近脑神经组织的成像（图5）。这两部分实验主要突出了如何利用VAMPIRE显微镜成像辨别不同神经元亚型，并进行功能对比。
图5 VAMPIRE系统对老鼠大脑皮层附近神经组织成像结果[1]
综合来看，VAMPIRE作为一个综合的光学成像平台，在神经元及其微环境成像中展现出极强的应用潜力，同时多种无标记成像模态的集合也使得它同样适用于其他生物医学的重要应用，未来有望应用于癌症生物学和生物膜成像研究。
参考文献：
[1] Iyer R R, Sorrells J E, Yang L, et al. Exploring the structure, metabolism, and biochemistry of the neuronal microenvironment label-free using fast simultaneous multimodal optical microscopy[J]. Optica, 2024, 11(9): 1352-1367.
原文标题 : 多光子显微镜成像技术之四十八 面向神经元微环境定量化成像的多模态无标记光学显微镜
