历经30余年的发展，多光子显微镜在诸多先进的光学显微技术中脱颖而出。得益于其亚微米级的高分辨率和独特的光学切片能力，多光子显微镜十分适合具备一定深度的在体生物成像，在神经科学，发育生物学及癌症研究中均发挥了举足轻重的作用。然而，传统多光子显微镜难以满足生物动力学的快速成像要求。无论是观察神经元的膜电位变化，细胞输运过程，还是横纹肌肌节的收缩过程，都远超传统多光子显微镜的时间分辨能力。为此，近年来研究者们提出了许多基于多光子显微镜的高速成像策略，令大范围实时监测生物组织成为可能［1］。
传统的多光子显微成像采用单焦点栅格扫描策略，基于各种激光扫描仪，如图1所示，振镜能提供～10 kHz的线扫速率，而旋转多面镜有～100 kHz的线扫速率。声光偏转器与电光偏转器更高，能达到数百千赫兹。但是，诸如记录神经元动态的成像需要千赫兹的平面帧速率，这相当于远超1 MHz的线扫描速率，这是当前任何激光扫描仪都无法达到的。因此，延续传统的栅格扫描策略并不可行。
图1 多光子显微成像的经典扫描方法：（a）检流计振镜对，（b）旋转多面镜，声光偏转器与电光偏转器，（c）压电扫描仪 ［1］。
千赫兹帧率的平面多光子成像往往涉及多焦点扫描的设计。如图2（a）所示，通过使用微透镜阵列，阵列光学元件或空间光调制器，输入激光束可被分解为数百个子光束，进而产生多个离散焦点。系统可以生成的焦点越多，同一视场下扫描所需的时间就越少。多个焦点所激发的多光子信号既可以使用探测器阵列／相机同时收集，也可以利用高速单像素探测器进行时分复用采集。一种被称为自由空间角啁啾延迟器（图2（b））的新技术通过一对近乎平行的反射镜，将入射激光转化为连续时分复用的焦点阵列，实现了高达3000 f．p．s．的平面帧速率。除此之外，通过衍射光栅构建的光谱编码（图2（c））亦能区分不同焦点激发的信号，不过这样会导致激发脉冲变宽，降低多光子激发的效率。
多焦点扫描本质上是一种通过并行化照明提高成像速率的思路，而原则上，宽场成像才是实现并行照明最直接的方式。在这种情况下，成像速度基本取决于相机的帧速率。尽管最先进的高速相机足以提供超过千赫兹的平面帧率，多光子宽场成像依然面临两个关键挑战。首先，大范围的视场照明显著降低了多光子激发的强度，从而降低了成像灵敏度。其次，宽场成像通常不具备轴向分辨能力，其散射背景更加严重，随着成像深度的增加，多光子图像的质量会大幅下滑。针对这些问题，时间聚焦（图2（d））和光片照明（图2（e））成为了实现多光子宽场成像的两种主要方式。时间聚焦使用包含空间色散的弱聚焦光束，令脉冲在焦平面中脉宽最窄，并在远离焦平面时迅速展宽，从而产生宽场的光学切片。光片照明的思路则更加直接，通过从样品侧面打入光片，只激发样品某一层平面的多光子信号，再用物镜即可进行深度分辨的宽场成像。值得注意的是，为了最大限度地提高多光子激发效率，减少生物样品在高速成像时的热负荷，实际的时间聚焦和光片显微镜通常不会是宽场照明，多被改进为一维线扫描的成像模式。
图2 千赫兹或亚千赫兹帧率的高速平面成像策略：（a）二维多焦点阵列扫描；（b）角啁啾相位延迟器；（c）光谱编码阵列扫描；（d）时间聚焦；（e）选择性平面照明显微镜；（f）断层扫描；（g）目标采样［1］。
除了并行化照明的策略，计算成像和目标采样也是实现千赫兹成像帧率的有效方法。线扫描角投影显微镜（图2（f））借鉴了计算机断层扫描的成像思路，通过沿四个不同方向线扫描整个视场，单像素探测器能快速获得样品在四个方向上的投影信息，进而重建出整个视场的多光子图像。目标采样（图2（g））则适用于事先已知生物样品部分空间信息的情况，借由空间光调制器或声光偏转器对，多光子显微镜可使光束仅扫描特定的数十个位置，而非对整个视场成像。这样构建一帧图像所需的时间即可大幅缩短，自然拔高了整体的成像帧速率。
多光子显微镜作为三维的成像方法，其体积帧率的提高离不开高平面帧率和高速轴向扫描的共同配合。传统多光子显微镜的轴向扫描基于机械致动的压电扫描仪（图1（c）），其体帧率因物镜的惯性受限于10 Hz以内。一种改进的方式为使用电可调谐透镜或超声透镜（图3（a）），无惯性约束的变焦可将体积帧率拓展至数十赫兹以上。另一种方法则是远程聚焦（图3（b）），其通过附加物镜和位于样品共轭平面上的扫描镜来控制焦点位移。由于这种远程扫描镜的质量轻，惯性低，其轴向扫描速率可达1 kHz以上，虽慢于超声透镜，但允许更大的焦移范围。在此基础上，更新颖的远程聚焦设计利用阶梯镜面将高速的平面栅格扫描转化为轴向扫描，获得了～12 kHz的轴扫描速率。
图3 高速轴向成像策略：（a）电可调谐透镜或超声透镜；（b）远程聚焦；（c）轴向多平面时空复用；（d）轴向投影［3］。
多焦点时空复用策略同样可以应用于高速轴向扫描中（图3（c））。方法是将激发脉冲分解成间隔数纳秒的时延子脉冲序列，然后分别聚焦在不同的成像深度，以实现多平面成像。该策略既可以通过简单的空间延迟线完成，也可以用混响光学环路来完成。值得注意的是，时间上越靠后的子脉冲往往聚焦于更浅层的组织平面，以平衡子脉冲序列中随时间下降的功率和组织中随深度递增的散射损耗，使所有成像平面产生统一水平的多光子信号。
对于稀疏标记的组织，因其少有互相重叠的结构，直接获取组织在轴向上的二维投影也是提高其体帧率的常见手段（图3（d））。在这种情况下，物镜后会产生一个轴向拉长的焦点，同时激发轴向所有的多光子信号，从而使平面帧率等同于体积帧率。轴向拉长的焦点通常以非衍射光束的形式生成，例如贝塞尔光束和艾里光束。除此之外，细长的立体V形光束通过产生空间上彼此偏移的双投影图像，在提升体帧率的同时编码了轴向信息。高体帧率多光子成像是在体生物动力学研究的基础。然而，生物动力学的研究尺度从单细胞覆盖至整个器官，涉及大脑深层局部和远程神经元的活动，对多光子显微镜的视场和成像深度均提出了不小的挑战。为发挥以上高速成像策略的全部潜力，多光子显微镜在其他维度的发展亦不容忽视。如图4所示，研究者们不仅定制了适配大光束直径，宽扫描角度的物镜和扫描系统来支持更大的视场，还结合更长的激发波段，自适应光学方法乃至多光子内窥镜组件用以提高成像深度。相应的超快激光技术与后续基于深度学习的图像处理也为优化信噪比处在不断的发展之中。
图4 多光子显微镜在视场，信噪比，穿透深度，时空分辨率等多个维度的前沿进展［1］。
为进一步突破非线性显微成像的性能，新一代的多光子显微镜势必会组合上述不同策略，而这将不可避免地增加系统的复杂性。高昂的成本会阻碍多光子显微镜的进一步发展和传播。因此，多光子显微镜的开发将更多关注于如何更便携地交付到生医领域的工作人员手中，以更快速地应用在不同的科研场景。为此，稳定便携且低成本的光纤超快激光源，每秒数百兆像素的实时数据处理系统，和适配现有显微镜的标准化高速成像附加组件，均是多光子显微镜未来发展的重中之重［1］。
参考文献：
［1］． Jianglai Wu， Na Ji and Kevin K． Tsia． Speed scaling in multiphoton fluorescence microscopy． Nature photonics 15， 800–812 （2021）．
原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十一 多光子显微镜高速成像技术
